1、实验应在超净工作台或者生物安全柜内进行;
2、实验的过程中选择尺寸的手套并能及时更换,在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套,以避免不同实验区交叉污染;
3、装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心,将管壁及管盖上的液体离至管底,降低污染手套或加样器的风险;谨慎开启反应管,防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染;需要高温加热的样本,可采用封口膜进行PCR管盖密封,避免管盖应受热而发生弹开;
4、吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行,遵守“慢吸快打”原则,尽量一次性完成,忌多次抽吸,以避免气溶胶产生的交叉污染;
5、PCR试剂建议小量分装,以减少反复冻融、重复取样次数和反复使用过程中的试剂污染;多样本PCR反应时,先配制反应混合液分装至反应管中,加入样本核酸,请勿同时开盖,尽量保证单人单管,实现完全闭管操作;
6、实验试剂应与样品和PCR产物分开保存,不应放于同处;
7、PCR扩增实验完成后及时将反应管取出,用一次性手套或者塑封袋将产物反应管包裹丢弃,保证管盖紧闭;
8、实验室自配试剂(去离子水、缓冲液等)和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌,尖、反应管等实验耗材应一次性使用。
实验结束后应该对操作台面,仪器,实验用具及环境进行清洁,这对污染的控制尤为重要。
1、实验后所有的试剂按照要求进行存放,废料和废液及时清理,避免存放过多和过久,废液缸用有效氯含量为2000mg/L消毒水浸泡消除核酸污染;
2、离心管架、试管架等可重复使用的物品浸泡到500mg/L 的消毒液中过夜,第二天用清水清洗后晾干使用;
3、对各区的生物安全柜、洁净工作台先用75%酒精或者500mg/L 的消毒液擦拭后采用紫外灯进行消毒处理;
4、配制含有效氯500mg/L的消毒液对设备表面、台面、地面、物品表面、传递窗内及门窗进行擦拭,再用纯化水对设备表面、台面、进行擦拭,避免消毒液对实验器具的腐蚀,仪器如核酸提取仪采用内部紫外消毒程序进行照射;
5、操作台面使用移动紫外消毒车近距离辐照1小时,应使灯管距离工作区的距离在60-90cm;实验室内则使用室内紫外灯整晚辐照。
测试吸头需使用经校准的移液器
(1)准确性:将n个吸头分别吸取定量的纯水称重,重量与体积的关系按照1 g/mL换算。
(2)气密性:取n个吸头,吸取量程的含有1%甘油的墨水,观察有色液体不出现在滤塞之上,液面相同为合格。
(3)防气溶胶性能:取n个吸头,吸取阳性核酸,反复吹吸10次,换另一个新吸头在阴性纯水中反复吹吸10次,取阴性纯水作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。
(4)污染物质检:取n个吸头,吸取阴性纯水反复吹吸10次,取阴性纯水作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。
(5)抑制物质检:取n个吸头,吸取弱阳性质控物反复吹吸10次,然后进行提取;吸取RNA核酸和DNA核酸反复吹吸10次,作为模板进行扩增,qPCR扩增未被抑制为合格。